基因工程技术是现代生物技术的集中体现，该技术自诞生以来取得的杰出成就深刻影响和促进了生命科学的发展和人类社会的进步。基因工程不仅是生物技术专业和生物工程专业的主要专业课，也是生物科学专业必须学习和掌握的基本理论知识和基本研究技能之一，因此该课程在所有相关学科中占有重要地位。常重杰主编的《基因工程》本着“重视基础、拓展眼界、联系实际”的原则，对基因工程的基本概念和重要研究技术原理进行了系统、翔实的介绍。同时，部分内容结合教学实践需要，介绍了该学科最新进展，并提供了重要文献和进一步阅读指南。
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《生命科学核心课程系列教材:基因工程》本着“重视基础、拓展眼界、联系实际”的原则，对基因工程的基本概念和重要研究技术原理进行了系统、翔实的介绍。同时，部分内容结合教学实践需要，介绍了该学科最新进展，并提供了重要文献和进一步阅读指南。
《生命科学核心课程系列教材:基因工程》可作为师范院校、综合性大学、农林院校相关专业本科生教材，同时也可作为相关专业研究生和科技工作者的参考用书。
目录
前言
第1章 绪论 1
1.1 基因工程的基本概念 1
1.2 基因工程的研究内容 2
1.3 基因工程诞生的基础 2
1.3.1 基因工程诞生的理论基础 2
1.3.2 技术上的三大突破 3
1.4 基因工程技术的诞生 3
1.5 基因工程的应用 5
1.5.1 原核细胞基因工程 5
1.5.2 植物基因工程 7
1.5.3 动物基因工程 8
1.5.4 基因治疗 8
1.5.5 理论研究 9
1.6 基因工程的安全性 9
1.7 我国的《基因工程安全管理办法》 11
思考题 12
参考文献 13
第2章 基因工程的基本技术 14
2.1 凝胶电泳技术 14
2.1.1 基本原理 15
2.1.2 琼脂糖凝胶电泳 15
2.1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 17
2.1.4 脉冲场凝胶电泳 18
2.1.5 双向电泳技术 20
2.1.6 凝胶电泳片段的回收与纯化 21
2.2 分子杂交技术 22
2.2.1 分子杂交的原理 22
2.2.2 分子杂交的类型 24
2.3 PCR技术 26
2.3.1 PCR基本原理和反应过程 26
2.3.2 PCR反应的体系及其设计和优化 28
2.3.3 PCR产物的克隆 31
2.3.4 PCR技术的发展及其应用 36
2.4 DNA序列分析 47
2.4.1 Maxam Gibert化学降解法 47
2.4.2 Sanger双脱氧链终止法 49
2.4.3 DNA序列分析的自动化 50
2.4.4 DNA序列的生物信息学分析 52
2.5 基因芯片及数据分析 53
2.5.1 基因芯片概念 54
2.5.2 技术原理 54
2.5.3 基因芯片的制备 54
2.5.4 基因芯片的应用 55
2.6 研究蛋白质与DNA相互作用的主要方法 57
2.6.1 酵母单杂交系统（可延伸双杂交） 57
2.6.2 凝胶阻滞试验（Gel shift） 57
2.6.3 DNase工足迹法 58
2.6.4 噬菌体展示技术 58
思考题 59
参考文献 59
第3章 基因工程的工具酶 61
3.1 限制性内切核酸酶 62
3.1.1 限制性内切核酸酶的发现与种类 62
3.1.2 限制性内切核酸酶的命名 63
3.1.3 Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性 63
3.1.4 影响限制性内切核酸酶活性的因素 66
3.1.5 限制性内切核酸酶酶切DNA的方法 68
3.2 DNA连接酶 68
3.2.1 DNA连接酶的发现 68
3.2.2 DNA连接酶的种类 69
3.2.3 黏性末端DNA片段的连接 69
3.2.4 平末端DNA片段的连接 71
3.2.5 影响连接反应的因素 73
3.3 DNA聚合酶和反转录酶 74
3.3.1 大肠杆菌DNA聚合酶工及其应用 75
3.3.2 E.coli DNA聚合酶工的Klenow大片段酶及其应用 76
3.3.3 T4噬菌体DNA聚合酶 77
3.3.4 T，噬菌体DNA聚合酶与测序酶 77
3.3.5 反转录酶 78
3.4 修饰酶类 79
3.4.1 末端脱氧核苷酸转移酶 79
3.4.2 T4多核苷酸激酶 79
3.4.3 碱性磷酸酶 79
3.5 其他工具酶 80
3.5.1 S1核酸酶 80
3.5.2 Bal 31核酸酶 81
3.5.3 核酸外切酶 82
3.5.4 RNA酶 83
思考题 84
参考文献 84
第4章 基因工程的克隆载体 85
4.1 质粒载体 86
4.1.1 质粒的一般生物学特性 86
4.1.2 质粒DNA的复制与拷贝数的控制 89
4.1.3 质粒DNA的分离与纯化 91
4.1.4 质粒载体的构建及类型 92
4.1.5 重要的大肠杆菌质粒载体 95
4.1.6 质粒载体的稳定性问题 99
4.2 噬菌体载体 100
4.2.1 噬菌体的一般生物学特性 100
4.2.2 入噬菌体载体 103
4.2.3 单链DNA噬菌体载体 107
4.3 柯斯质粒载体 112
4.3.1 柯斯质粒载体的构建及其特点 112
4.3.2 柯斯克隆 113
4.3.3 柯斯克隆的改良 114
4.4 噬菌粒载体 116
4.4.1 噬菌粒载体的概念 116
4.4.2 pUC118和pUC119噬菌粒载体 117
4.4.3 pBluescript噬菌粒载体 118
4.5 人工染色体克隆载体 119
4.5.1 构建大容量载体的必要性 119
4.5.2 人工染色体的必需成分 120
4.5.3 酵母人工染色体载体 120
4.5.4 细菌人工染色体载体 122
4.5.5 Pl人工染色体 123
4.5.6 人类人工染色体 123
4.5.7 植物人工染色体 124
思考题 124
参考文献 125
第5章 目的基因的获取与改造 126
5.1 DNA的人工合成 126
5.1.1 人工合成DNA的原理 126
5.1.2 人工合成DNA的应用 128
5.2 从基因文库获取目的基因 130
5.2.1 基因组文库的构建与筛选 130
5.2.2 cDNA文库的构建与筛选 136
5.2.3 基因组文库与cDNA文库的区别 140
5.3 PCR技术与目的基因的分离 141
5.3.1 目的基因的直接扩增和克隆 141
5.3.2 目的基因的cDNA的克隆 141
5.4 电子克隆获取目的基因 141
5.4.1 电子克隆的基本原理 142
5.4.2 利用EST数据库进行电子克隆 142
5.4.3 利用基因组数据库进行电子克隆 143
5.4.4 全长cDNA的判断 143
5.5 根据基因差异表达获得目的基因 143
5.5.1 mRNA差异显示技术． 143
5.5.2 cDNA代表性差异分析 145
5.5.3 抑制差减杂交技术 145
5.6 目的基因的改造 147
5.6.1 基因突变与人工诱变技术 147
5.6.2 基因走点诱变 149
5.6.3 基因随机突变 151
思考题 153
参考文献 153
第6章 目的基因的导入与重组体的鉴定 155
6.1 重组DNA向原核细胞的导入． 155
6.1.1 原核受体细胞的种类及特点 155
6.1.2 转化 156
6.1.3 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 157
6.1.4 重组入噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 160
6.2 重组DNA导入真核细胞 16l
6.2.1 真核受体细胞 161
6.2.2 重组DNA分子导入酵母细胞 162
6.2.3 重组DNA分子导入植物细胞 162
6.2.4 重组DNA分子导入哺乳动物细胞 164
6.3 重组体克隆的筛选与鉴定 167
6.3.1 载体遗传标记筛选法 167
6.3.2 依赖于重组子结构特征分析的筛选法 171
6.3.3 核酸分子杂交检测法 172
6.3.4 免疫化学检测法 174
6.3.5 翻译筛选法 175
6.3.6 亚克隆法 176
6.3.7 插入失活法 176
6.3.8 电子显微镜作图检测法 177
6.3.9 转录产物作图 177
6.3.10 基因表达产物分析法 177
6.3.11 DNA序列测定法 178
思考题 179
参考文献 179
第7章 外源基因的原核表达系统 180
7.1 原核表达系统的特点 180
7.1.1 原核生物的转录 180
7.1.2 原核生物的翻译 181
7.2 原核细胞表达体系 182
7.2.1 大肠杆菌表达体系 182
7.2.2 芽孢杆菌表达体系 185
7.2.3 链霉菌表达体系 186
7.2.4 蓝藻表达体系 188
7.3 提高外源基因表达水平的措施 190
7.3.1 优化表达载体的设计 190
7.3.2 避免使用稀有密码子 190
7.3.3 提高外源基因mRNA的稳定性 190
7.3.4 提高表达蛋白的稳定性，防止其降解 191
7.3.5 减轻细脆的代谢负荷，提高外源基因的表达水平 191
7.3.6 优化发酵条件 191
7.4 利用原核细胞生产真核蛋白质的实例 191
7.4.1 干扰素基因工程 191
7.4.2 生长激素基因工程 192
7.4.3 生长激素释放抑制因子基因工程 193
7.4.4 胰岛素基因工程 194
7.4.5 α-淀粉酶基因工程 195
7.5 目的蛋白的纯化 197
7.5.1 组氨酸标签 197
7.5.2 GST 标签 198
7.5.3 MBP标签 199
7.5.4 IMPACT 199
7.5.5 TAP 标签 200
思考题 201
参考文献 20l
第8章 外源基因的真核表达系统 202
8.1 真核细胞表达体系的特点 202
8.1.1 利用真核细胞作宿主系统的优点 202
8.2 酵母表达系统 203
8.2.1 酵母基因表达载体的构成 203
8.2.2 酵母基因表达载体的种类 204
8.2.3 酵母基因表达系统宿主菌 207
8.2.4 在酵母中高效表达外源基因的策略 207
8.3 昆虫或昆虫细胞表达体系 208
8.3.1 以重组杆状病毒为载体的昆虫表达体系 209
8.3.2 杆状病毒表达系统的效率与加工能力 209
8.3.3 一类稳定转化的昆虫表达系统 211
8.4 哺乳动物细胞基因表达系统 212
8.4.1 哺乳动物基因表达载体的组成特征 213
8.4.2 哺乳动物基因表达载体 214
8.4.3 哺乳动物基因表达宿主细胞 220
8.4.4 提高哺乳动物基因表达系统表达效率的因素 221
思考题 221
参考文献 222
第9章 转基因动物 223
9.1 转基因动物发展简史 223
9.2 转基因动物技术 225
9.2.1 外源基因导入动物细胞的方法 225
9.2.2 转基因动物技术的新发展 234
9.3 转基因动物的制备和检测 240
9.3.1 以显微注射小鼠为例介绍转基因动物的制备 240
9.3.2 转基因的鉴定和表达水平检测 241
9.4 转基因动物研究中出现的问题及其对策 243
9.4.1 转基因动物效率极低 243
9.4.2 难以控制转基因在寄主基因组的行为 244
9.4.3 大部分转基因表达水平极低 244
9.4.4 转基因表达特征及提高转基因表达的策略 245
9.5 转基因动物的应用 246
9.5.1 在生产和生活中的应用 246
9.5.2 在生物制药方面的应用——动物生物反应器 247
9.5.3 在疾病研究中的应用 249
9.5.4 在基础研究中的应用 250
9.6 转基因动物的安全性及其未来 250
9.6.1 食品安全性 251
9.6.2 环境安全性 25l
思考题 252
参考文献 252
第10章 转基因植物 254
10.1 转基因植物概述 254
10.2 转基因植物的基因转化方法 255
10.2.1 转基因植物受体系统 255
10.2.2 农杆菌介导的植物基因转化技术 256
10.2.3 DNA直接导入的基因转化技术 262
10.2.4 花粉管通道法介导的基因转化技术 264
10.3 转基因植物的检测方法 265
10.3.1 基于报告基因／选择标记基因的转基因植物检测方法 265
10.3.2 基于报告基因的转基因植物的外源基因表达检测 266
10.3.3 外源目的基因整合的鉴定 267
10.4 抗虫转基因植物 268
10.4.1 来源于微生物的抗虫基因 268
10.4.2 来源于植物的抗虫基因的应用 270
10.5 抗细菌转基因作物 272
10.5.1 裂解细菌细胞壁 272
10.5.2 破坏细菌细胞膜 273
10.5.3 解除细菌毒素的毒性作用 274
10.5.4 引入对细菌毒素不敏感的靶酶 274
10.5.5 增强植物本身的防卫蛋白合成 274
10.6 抗病毒转基因作物 275
10.6.1 利用非病毒来源的抗病毒基因策略 275
10.6.2 利用病毒来源基因的抗病毒策略 276
10.7 抗除草剂转基因作物 279
10.7.1 增加靶标酶或靶标蛋白的拷贝数 279
10.7.2 作用靶标酶的修饰 279
10.7.3 分离能解除除草剂毒性的酶基因 280
10.7.4 新型除草剂的发展方向 280
10.8 抗逆境转基因作物 280
10.8.1 抗干旱胁迫策略 280
10.8.2 抗寒冻胁迫策略 281
10.8.3 抗盐碱胁迫策略 282
10.9植物生物反应器 282
10.9.1 植物生物反应器的优点 282
10.9.2 植物生物反应器的研究现状 283
10.9.3 植物生物反应器存在的问题 283
10.10 转基因沉默的原因及对策 284
10.10.1 转基因沉默的原因 284
10.10.2 控制转基因沉默的策略 285
10.11 转基因植物的安全性评价 285
10.11.1 转基因植物食品的安全性评价 286
10.11.2 转基因植物生态环境的安全性评价 288
思考题 290
参考文献 290
第11章 基因治疗 291
11.1 基因治疗的基本概念 291
11.2 基因治疗的发展简史与现状 291
11.3 基因治疗的策略 294
11.3.1 根据基因导入体内的方式 294
11.3.2 根据导入基因发生作用的方式 295
11.4 基因治疗的流程 295
11.4.1 目的基因的准备 295
11.4.2 靶细胞 295
11.4.3 载体的选择 295
11.4.4 转移技术 296
11.5 基因治疗的应用 304
11.5.1 肿瘤的基因治疗 305
11.5.2 单基因病的基因治疗 312
11.5.3 艾滋病等感染性疾病的基因治疗 315
11.6 基因治疗的前景 316
11.6.1 基因治疗面临的问题和挑战 316
11.6.2 基因治疗的发展方向 317
思考题 317
参考文献 317
第12章 合成生物学与基因工程 319
12.1 合成生物学 319
12.1.1 合成生物学的定义 319
12.1.2 合成生物学的研究内容 320
12.1.3 合成生物学的工程本质 325
12.1.4 合成生物学的意义 327
12.1.5 合成生物学的应用 328
12.2 合成生物学与基因工程 331
12.2.1 合成生物学与基因工程的差异 332
12.2.2 合成生物学与基因工程相似之处 333
思考题 334
参考文献 334
附录 总复习题 335
在实际应用方面，生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、航天等许多领域。在疾病诊断方面，由博奥生物有限公司研发的多重等位基因特异性PCR通用芯片（allele—specific PCR—baseduniversal array，ASPUA），可在5h之内完成导致遗传性耳聋的4种常见基因（GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体基因）的检测；我国军事医学科学院已先后研制出快速检测甲型H1N1流感病毒检测基因芯片以及专门针对甲型H1N1流感病毒抗药性的基因确诊和耐药性分析的基因芯片等。在司法方面，便携式DNA芯片检测装置可以直接在犯罪现场对可能是疑犯留下来的头发、唾液、精液等进行分析，并立刻与DNA罪犯指纹库系统存蓄的DNA“指纹”进行比较，进行快速准确地破案。在药物筛选方面，博奥生物芯片有限公司研发的“超高通量药物筛选芯片”每小时能做380个细胞分析，而一个科研人员一天最多只能分析五六个细胞，这意味着药物研发效率的飞跃，同时新药物研发费用也大大降低。在农林方面，目前已利用基因表达谱芯片进行了植物激素的中心作用、植物基因与环境的相互影响、多种因素（肥力、种子、环境耐受力和抗虫害等）与植物基因表达的关系的研究，最终有可能用生物芯片技术取代现在沿用的费时费钱的大田试验模式。在食品安全方面，世界上第一个能够检测肉类中兽药残留的生物芯片系统在北京国家工程研究中心研制成功，该芯片能够分析大量的生物分子，快速准确地完成肉类中兽药残留的检测工作。目前，美国国立环境卫生研究院已开发出检测环境有毒物的毒理芯片去评估未知化合物或混合物的潜在危害。在国防方面，生物战剂与化学战剂的侦检是一项很复杂且又十分重要的工作，可以采用基因芯片技术检测细菌、病毒、支原体、衣原体、立克次氏体等微生物；随着许多威胁人类健康的疾病基因、各种与体能有关基因及机体对特殊环境的适应基因的陆续发现，使得分子选兵成为可能，生物芯片将广泛用于分子选兵，尤其是对特种士兵的筛选以及军人体能评价等领域。
总之，随着大规模基因组测序的完成，生物学家开始从相对静态的基因组研究转向更为动态的基因表达过程研究。通过对不同细胞类型之间表达模式差异的研究，可以从动态的角度刻画出一幅生命活动的“动画”，来进一步探索生命的奥秘。在这一过程中，芯片技术展现出巨大的应用前景。基因芯片将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化，为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。
2.6 研究蛋白质与DNA相互作用的主要方法
DNA—蛋白质相互作用的研究是21世纪生命科学研究的主要课题之一，涉及了多学科前沿交叉领域里的相关知识和技术方法。弄清DNA—蛋白质相互作用的机制，对我们了解DNA转录调控和基因表达机制，揭示各种生命活动现象具有极其重要的指导作用。研究DNA蛋白质相互作用的实验方法主要包括凝胶阻滞实验、酵母单杂交体系、DNase Ⅰ足迹实验、噬菌体展示技术和荧光技术等。
2.6.1酵母单杂交系统（可延伸双杂交）
该技术是由J.J.Li和I.Herskowitz从酵母双杂交技术发展来的。它通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴定DNA顺式作用元件和转录因子的结合情况；通过筛选DNA文库来获得与靶序列特异结合的蛋白质基因序列。它的原理（图2—28）是：根据大多数转录因子含有DNA结合结构域（DNA—binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD），且两结构域可完全独立地发挥作用的特点，来设计携带有编码“靶蛋白”的文库质粒，从而使文库蛋白编码基因置换酵母原有转录因子CAL4的DNA结合结构域，并通过表达的“靶蛋白”与目的基因相互作用来激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。由此可见，该系统需包含：①将文库蛋白的编码基因与转录激活域融合表达的cDNA文库质粒；②含目的基因与下游报告基因的报告质粒。其中，文库的设计和筛选实验是整个酵母单杂交系统的核心技术。
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