《显微形态学实验（组织学与胚胎学分册）（第2版）》共分三篇。第一篇为常用仪器及基本实验技术，主要介绍形态学常用的显微镜的构造和使用，常用实验方法的原理、操作步骤及注意事项；第二篇为验证性实验，为传统形态学实验部分，主要描述细胞、组织、器官的正常形态结构及胚胎发生过程；第三篇为综合创新性实验，主要介绍了一些组织学与胚胎学研究方法的基本原理、实验步骤和应用。

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目录
第一篇常用仪器及基本实验技术
第一章光学显微镜的结构和使用（1）
第二章组织切片制作（10）
第三章组织切片常用染色方法（13）
第四章免疫组织化学技术（14）
第五章组织细胞培养技术（21）
第六章常用电镜技术（25）
第二篇验证性实验
第一章组织学绪论（30）
第二章上皮组织（33）
第三章结缔组织（39
第四章血液与血细胞发生（44）
第五章软骨组织和骨组织（48
第六章肌组织（53）
第七章神经组织（58）
第八章神经系统（64）
第九章眼和耳（67）
第十章循环系统（75）
第十一章皮肤（80）
第十二章免疫系统（84）
第十三章内分泌系统（90）
第十四章消化管（95）
第十五章消化腺（103）
第十六章呼吸系统（110）
第十七章泌尿系统（114）
第十八章男性生殖系统（119）
第十九章女性生殖系统（123）
第二十章胚胎学绪论（130）
第二十一章胚胎发生总论（131）
第二十二章颜面的发生（142）
第二十三章消化系统和呼吸系统的发生（144）
第二十四章泌尿系统和生殖系统的发生（148）
第二十五章心血管系统的发生（153）
第二十六章神经系统、眼和耳的发生（162）
第三篇综合创新性实验
第一章快速疏松结缔组织铺片的制作（166）
第二章显示脂肪的染色法（167）
第三章白细胞分类计数（170）
第四章胰岛中3种主要内分泌细胞的鉴别（172）
第五章PAS染色法显示肝糖原（174）
第六章生精细胞凋亡的检测（175）
第七章鼠胚胎标本的制作（177）
第八章骨髓基质干细胞的分离和培养（179）
第九章精液常规检查（180）
附录Ⅰ《组织学与胚胎学》实验教学大纲（183）
附录Ⅱ《组织学与胚胎学》课程考试大纲（199）

第一篇　常用仪器及基本实验技术
本篇主要介绍显微形态学实验的常用仪器和基本实验方法，包括多种显微镜的构造和使用方法，常用切片制作技术和染色方法，免疫组化、组织细胞培养技术及常用电镜技术等。
第一章　光学显微镜的结构和使用
一、普通光学显微镜的结构和使用
1. 成像原理与构造　光学显微镜利用凸透镜放大成像原理，将肉眼不能分辨的微小物体通过物镜、目镜两次放大成像，便于人们提取观察对象的微细结构信息。普通光学显微镜由机械装置和光学系统两部分构成（图1-1-1）。
图1-1-1　普通光学显微镜结构示意图
（1）机械装置
1）镜座：位于显微镜底部，支持全镜。
2）镜柱：下端连镜座，上端与镜臂相连。
3）镜臂：呈弓形，位于镜柱上方，支持镜筒，是取用显微镜时握拿的部位。
4）镜筒：位于镜臂的前面，上端装有目镜，下端连旋转盘。根据镜筒的数目，显微镜可分为单目镜和双目镜两类。
5）旋转盘：又称物镜转换器，为接于镜筒下方的圆盘，其上嵌有3～4个物镜，旋转物镜转换器，可调换不同放大倍数的物镜。
6）载物台：四方形或圆形平台，供放置载玻片或标本之用，中央有一通光孔。
7）片夹：载物台上用于固定载玻片或标本的镰刀形弹簧夹，其左边可以向外拉开。片夹常被固定在推片器的推进齿条上。
8）推片器：是移动标本的机械装置，由一横一纵两个推进齿轮和齿条构成，调节推片器的旋钮位于载物台一侧的下方，转动旋钮可以使载玻片前后左右移动。
9）调焦螺旋：粗调焦螺旋与细调焦螺旋合在一起，位于镜臂上端或镜柱两侧，转动调焦螺旋可上下移动载物台，从而调节焦距使之清晰成像。粗调焦螺旋（大螺旋）可使镜筒或载物台按垂直方向做较大距离的升降，用于低倍镜观察时的焦距调节。细调焦螺旋（小螺旋）可使镜筒或载物台做很小距离的升降，适用于高倍镜和油镜观察时的清晰成像，其构造精密，不宜旋转过多、过快。
（2）光学系统
1）目镜：装于镜筒上端，由两块透镜组成。亦分高倍与低倍两种。高倍者较短，其上刻有10×或15×；低倍者较长，其上刻有5×或8×字样。目镜内常装有指针，用以指示视野中的某一目标供他人观察。
2）物镜：装于旋转盘上，一般有低倍物镜、高倍物镜及油镜三种。低倍镜短，其上刻有10/0.25字样，10代表该物镜的放大倍数，0.25表示数值孔径，物镜的分辨率及放大倍数与数值孔径成正比。标本的放大主要由物镜完成，物镜放大倍数越大，它的焦距越短，物镜与玻片间的距离越小。高倍镜与油镜较长，其上分别刻有40/0.65及100/1. 25等字样（图1-1-2）。当物像清晰时，物镜镜面与盖玻片上表面之间的距离称工作距离。物镜的放大倍数与其工作距离成反比（图1-1-2）。当低倍镜被调节到工作距离后，可直接转换高倍镜或油镜，稍微调节细调焦螺旋便可见到清晰的物像，这种情况称为同高调焦。
光镜的放大率等于目镜和物镜放大倍数的乘积。
图1-1-2　普通光学显微镜物镜及其工作距离示意图
3）聚光器与虹彩光圈：聚光器位于载物台通光孔下方，由一组透镜组成，能将反光镜所反射之光线或照明灯泡之光线汇聚至所观察的标本。载物台下方有一小螺旋，转动时可升降聚光器。上升时光线强，下降时光线弱。虹彩光圈位于聚光器下方，由多个活动钢片组成，中心形成圆孔，其外侧有一小手柄，拨动时能调节光圈大小，以调节光线的强弱。
4）光源：反光镜或照明灯泡。反光镜位于镜座上方，能向各方转动，使光线反射至聚光器；照明灯泡通常安装在镜座内，其附近有电源开关及光线强弱调节旋钮。
2. 使用方法
（1）对光：将低倍镜转到对准通光孔的位置，上升聚光器，打开光圈，打开电源开关后转动光线强弱调节旋钮或调整反光镜的角度，若用双目镜观察标本，应用双眼自目镜中观察，调至整个视野非常明亮为止，同时调节两个目镜间的距离，直到双眼看到一共同视野为止。用单目镜观察标本时，应练习两眼同时睁开，以减少视觉疲劳；用左眼自目镜中观察，右眼用于绘图和记录实验结果。
（2）置片：将组织切片有盖玻片的一面朝上，置于载物台上，将片夹左边向外拉开，把标本玻片平移入片夹内，轻轻弹回片夹左边，卡住固定好标本，转动推片器调节旋钮，将观察目标移至通光孔中央。
（3）调节焦距：切片放好后，先慢慢转动粗调焦螺旋使载物台上升，同时双眼从侧面注视切片与物镜间距离，当物镜镜头与切片相距约0.5cm时，眼睛从目镜中观察，边观察边将载物台慢慢下降，直到物像清晰为止。若物像不够清晰，可用细调焦螺旋调节。
（4）低倍物镜转高倍物镜：低倍镜看清物像后，将要观察的目标移至视野中央，直接转动物镜转换器由低倍镜转至高倍镜。转至高倍镜后，一般即可见模糊的物像，注意此时千万不要转动粗调焦螺旋及提升载物台，只需用细调焦螺旋稍加调整即可见清晰的物像。
（5）油镜的用法：使用油镜时，应先在高倍镜下看清物像，并将要观察的目标移至视野中央，移开高倍镜，在通光孔位置的标本上滴一小滴香柏油后，转动物镜转换器至油镜对准通光孔。从侧面观察，可见油镜头下端与切片上的镜油充分接触。此时目镜内观察一般也可见模糊的物像，缓慢转动细调焦螺旋直至看到清晰物像。
油镜用完后，先转动粗调焦螺旋下降载物台并将油镜转离通光孔，用干擦镜纸揩擦镜头一次，以去除大部分的油，再用沾有少许清洗剂的擦镜纸缓慢、仔细擦拭一次，以将油彻底去除，最后用干擦镜纸再擦拭一次，以将清洗剂去除。切片的处理方法与油镜头相似。
3. 使用注意事项　显微镜是精密的光学仪器，若使用不当，常会造成巨大损失，故要求同学们在使用时必须严格遵守下列规定：
（1）使用结束后，先将光调节器调至最小，关闭电源。
（2）搬动显微镜时必须双手持镜，以右手握紧镜臂，左手托住镜座，平贴胸前，以防撞碰。禁止单手提镜或使镜倒转，以免零件落地打破。
（3）使用前应检查显微镜的主要部件有无缺损；使用时应正确、缓慢的旋动有关机械部分。
（4）如遇镜头模糊不清时，严禁用手或粗布、粗纸等拭擦镜头，只能用擦镜纸轻轻拭擦。
（5）更换切片标本时，应先转开物镜，再取出或放置切片标本。
（6）使用油镜时，应首先鉴别高倍镜和油镜这两种镜头，切勿将油镜当高倍镜使用。
（7）不要随便取出目镜，以免灰尘落入镜筒内影响观察。
（8）不得自行拆卸修理显微镜，如有故障应立即报告老师。
（9）显微镜用完后，应将镜头转在交叉位置移离通光孔，载物台降到最低位置，降下聚光器，盖好防尘罩放回原处。
二、倒置相差显微镜的结构和使用
1. 成像原理与构造　普通光学显微镜一般不能分辨未染色细胞的细微结构，这是因为各细微结构的折光性接近或对比度不够。倒置相差显微镜，是相差显微镜和倒置显微镜相结合的产物，倒置相差显微镜既具有倒置显微镜的倒置观察方式，同时又具有与相差显微镜相一致的成像原理（图1-1-3）。
倒置显微镜组成和普通显微镜一样，主要包括三部分：机械部分、照明部分、光学部分。相比于普通显微镜，倒置显微镜的物镜与照明聚光系统以载物台为轴颠倒位置，物镜在载物台之下，照明系统在载物台之上。这样的构造使得照明聚光系统与载物台的有效距离可以显著扩大，便于放置培养皿、细胞培养瓶等较厚的待观察器具，而同时物镜与材料之间的工作距离不必很大。一般研究用倒置显微镜都配有4×、10×、20×、40×相差物镜。
相差显微镜和普通显微镜的主要区别是用环状光阑代替可变光阑，用带相板的相差物镜（相板能将直射光和衍射光的相位差转变为振幅差，使明暗反差加强）代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。活细胞和未染色生物标本各部分细微结构的折射率和厚度不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅发生人眼无法观察的相位变化（光程差）。相差显微镜通过带有环状光阑的聚光镜和相差物镜改变这种相位差，把相位差变为振幅（光强度）差从而实现观测。
相差显微镜主要用于观察生长在培养瓶中的活细胞或未染色的组织切片，有时也可用于观察缺少反差的染色标本。
2. 使用方法
（1）开机：打开镜体下端的电源开关。
（2）调节光源：旋转物镜转换器，选择放大倍数较小的物镜，同时调节镜体下端的光线亮度螺旋，并通过调节聚光镜下面的光阑来调节光源的大小。
（3）调节焦距：将待观察对象置于载物台上，慢慢转动粗调焦螺旋使物镜升降，见到物像后再用细调焦螺旋调至物像清晰，并消除或减小图像周围的光晕，提高图像的衬度。调节焦距可看到不同焦距水平的细胞。随后移动载物台上的观察对象，选择观察视野并拍照或利用与显微镜连接的计算机采集数码图像。根据需要可转换至高倍镜观察。
（4）关机：取下观察对象，旋转光源亮度螺旋至最暗。关闭镜体下端的电源开关，并旋转物镜转换器，使物镜置于载物台下，防止灰尘沉降其上。
3. 使用注意事项　与普通光学显微镜基本相同。
三、荧光显微镜的结构和使用
1.成像原理与构造　荧光显微镜（fluor-escence microscope）也是光学显微镜的一种，由普通光学显微镜加上一些附件（如荧光光源、荧光镜组件）组成，结构如图1-1-4所示。荧光显微镜的原理是利用高效发光光源，经过虑色系统发出一定波长的光作为激发光，激发检测样品内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再经物镜和目镜进行放大以观察标本的荧光图像。荧光显微镜主要用于细胞结构、功能及化学成分等的研究。
荧光显微镜由光源、滤色系统和光学系统等主要部件组成（图1-1-4）。光源一般采用超高压汞灯，该灯可发出各种波长的光，每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用滤色系统仅使一定波长的激发光经物镜照射至标本上。滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。根据光源和荧光色素的特点，可选用紫外、紫色、蓝色或绿色激发滤板，分别提供一定波长范围的激发光。压制滤板与激发滤板相对应，其作用是完全阻挡激发光进入目镜，以免干扰荧光和损伤眼睛，同时让特异波长范围的荧光选择透过，以显示专一的荧光色彩。故压制滤板与激发滤板必须选择配合使用。
荧光显微镜按照明方式可分为落射式和透射式两类。落射式荧光显微镜是近代发展起来的新式荧光显微镜，透射式荧光显微镜较为原始，其激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。目前荧光显微镜照明方式通常为落射式，其成像原理是激发光通过双色束分离器反射至物镜，向下落射到标本表面，样品所产生的荧光以及由物镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，返回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光被压制滤板吸收，因此物镜同时具有照明聚光器和收集荧光的作用（图1-1-5）。
2. 使用方法
（1）开机：打开紫外灯电源，超高压汞灯要预热15min才能达到最亮点。
（2）选择相应的滤色系统：透射式荧光显微镜需在光源与暗视野聚光器之间装上所要求的激发滤板，在物镜的后面装上相应的压制滤板。落射式荧光显微镜需根据样品的荧光指示剂，在光路的插槽中插入所要求的激发滤板、双色束分离器、压制滤板的插块即旋转荧光组件室数码圆盘，以满足不同荧光反应产物的需要，分别对应如下：
WB——适用于FITC荧光抗体染色的样品观察，阳性染色为绿色。
WG——适用PE或Cy3荧光抗体和罗丹明染色的样品观察，阳性染色为红色。
WU——适用于紫外光荧光染色的样品观察，阳性染色为蓝色。
（3）调节光源：将荧光指示剂标记好的样品放存载物台后，低倍镜对准通光孔，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。
（4）调焦距：按照普通光学显微镜的使用方法调焦距至物像清晰为止。根据需要可转换至高倍镜或油镜观察。同时利用与显微镜连接的计算机采集数码图像。
3. 注意事项
（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。
（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5
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